Kada se odlučite za kataloški broj koji Vam je potreban (vidi FAQ-1), pošaljite nam e-mailom u WORD DOKUMENTU sljedove svojih početnica i proba i to prema sljedećim primjerima. Molimo Vas da posebnu pozornost obratite na sintaksu.

Primjer 1. Potrebne su Vam neobilježene pročišćene početnice za kvantitativni PCR. Prema FAQ-1, kataloški broj (part number, P/N) za količinu od 10 nmol jest: 4304970. Recimo da je slijed jedne početnice: ACGTACGTACGTACGTAT te neka je njen zamišljeni naziv „Oligo 1”; slijed druge početnice neka bude ATTCGTACAGTACGTACGT, a , primjera radi, naziv bi mogao biti „Oligo 2”.
Molimo Vas da imate na umu: 1) slijed oligonukleotida nam navodite u pravcu 5’ ---> 3’, 2) naziv/ime je slobodno ali smije imati do 16 znakova, a navedite ga jedan redak iznad samoga slijeda. U ovom primjeru prikladno oblikovana narudžba izgledala bi ovako.

4304970
Oligo 1
ACGTACGTACGTACGTAT
Oligo 2
ATTCGTACAGTACGTACGT

Primjer 2. Potrebna Vam je početnica koja je na kraju 5’ fluorescentno obilježena. Ukoliko Vam odgovara količina od 10 nmol, odlučujete se za kataloški broj 450007. Slijed jedne početnice jest: ACGTACGTACGTACGTAT, nazvali ste ju „Oligo 1”, dok je slijed druge ATTCGTACAGTACGTACGT, a odlučili ste ju zvati „Oligo 2”. Naziv/ime je slobodno ali smije imati do 16 znakova.
Slijed smije biti duljine 10 – 50 baznih parova, boju pišete neposredno prije samog slijeda, odvojeno minusom (-). Dakle: boja-slijed. Također, boju FAM pišete kao „6FAM”. U ovom primjeru prikladno oblikovana narudžba izgledala bi ovako.

450007
Oligo 1
6FAM-ACGTACGTACGTA
Oligo 2
6FAM-ACGTACGTACGTAC

Primjer 3. Želite naručiti par početnica pri čemu je jedan član para fluorescentno obilježen na kraju 5’, dok je drugi član para, tj. druga početnica neobilježena. Primjera radi, sljedovi prvog para su ACGTACGTACGTACGTA (obilježen, nazvan „Oligo 1”) te ATTCGTACAGTACGTACGT (neobilježen, nazvan „Oligo 2”). Ime prvoga para je „Pair 1”. Drugi par početnica nazvali ste „Pair 2”, odgovarajući slijedovi su ACGTACGTACGTACGTA (obilježen, nazvan „Oligo 1”) te ATTCGTACAGTACGTACGT (neobilježen, nazvan „Oligo 2”).
Za imenovanje para navodite se istim pravilom kao i za imenovanje početnice, dakle do 16 znakova - naziv/ime je slobodno ali smije imati do 16 znakova.
U ovom primjeru prikladno oblikovana narudžba izgledala bi ovako.

450056 
Pair1 Oligo1
6FAM-ACGTACGTACGTA
Pair1 Oligo2
ACGTACGTACGTAC
Pair2 Oligo1
VIC-ACGTACGTACGTA
Pair2 Oligo2
ACGTACGTACGTAC

   Prva dva slova u ID nazivu eseja predstavljaju vrstu organizma.

Hs – Homo sapiens

Mm – Mus musculus

Rn – Rattus norvegicus

Dm – Drosophila melanogaster

At – Arabidopsis thaliana

Ce – Caenorhabditis elegans

Cf – Canis familiaris

Rh – Macaca mulatta (Rhesus)

Dr – Danio rerio (Zebrafish)

Oznaka iza donje crte u ID nazivu eseja predstavlja smještaj eseja.

_s1 - Ova oznaka znači da su i početnice i proba smješteni unutar jednog egzona i samim tim će otkriti i genomsku DNA . 

_m1 - Eseji su oblikovani tako da je proba smještena na granici egzon-egzon i otkrit će samo mRNA, a ne će otkriti DNA.

_g1 - Esej s ovom oznakom mogao bi otkriti i genomsku DNA. Probe i početnice ovog eseja mogu se nalaziti u samom egzonu.

Rjeđe koritštene oznake su sljedeće.

“_mH”, “_sH”, or “_gH” znači da je esej oblikovan prema prijepisu (transcript) koji pripada genskoj porodici s visokom homologijom sljedova. Esej je oblikovan tako da je diskriminacija u odnosu na najsrodniji homologni transkript 1000 do 30 000 puta veća.

“_u” označava esej u kojem amplikon premoštava (to span) spoj egzona, a proba u cijelosti leži u jednom od na taj način spojenih egzona.

“_ft” ukazuje da je esej oblikovan tako da otkriva fuzijski prijepis koji nastaje kromosomskom translokacijom. Proba i jedna početnica nalaze se s jedne strane prijelomne točke (fusion transcript breakpoint), dok se preostala početnica nalazi sa suprotne strane. Esej ne otkriva genomsku DNA.

“_at” znači da je esej oblikovan kako bi otkrio specifični prijepis RNA s jedinstvenim slijedom koji nema homologiju s trenutno pohranjenim biološkim sljedovima.

   Applied Biosystems nudi dva oblika TaqMan proba, s obzirom na njihovo obilježavanje na kraju 3':

1) probe s bojom TAMRA;

2) probe s vezivačem za manji urez (MGB; minor groove-binder) i nefluorescentnim hvatačem (quencher) fluorescencije.

TAMRA

TAMRA je i sama flourescenta boja što u biti znači da Vam prilikom umnogostručene reakcije (multiplexing) oduzima jedan detekcijski kanal. Mogu se primijeniti za genski izražaj (gene expression) i otkrivanje patogena.

MGB

Applied Biosystems načelno preporučuje opću uporabu proba MGB. Kako probe MGB imaju nefluorescentni hvatač na kraju 3', uređaj može preciznije izmjeriti signal koji dolazi od izvjestitelja (reporter), a i razina pozadinske fluorescencije (background) je niža. Molekula MGB povećava temperaturu taljenja (Tm) proba te time omogućava uporabu kraćih proba. U skladu s tim, probe MGB imaju veće razlike u temperaturama taljenja između pravilno (matched) i nepravilno (mismatched) pridruženih proba, što je osobito važno za alelno razlikovanje (allelic discrimination).

Neobilježene početnice P/N 4304970 isporučuju se u liofiliziranom stanju u količini od 10 nmola (standard za small-scale količinu). Kako biste dobili temeljnu (stock) otopinu od uobičajenih 100 pmola/µL (= 100 µM), rekonsituirajte početnice dodavanjem 100 µL 1× TE pufera (1 mM Tris, 0.1 mM EDTA, pH 8.0) ili sterilne, ddH2O, slobodne od nukleaza. Temeljnu je otopinu preporučljivo držati na -20 °C i što ju rjeđe smrzavati i razrjeđivati (preporučamo ne više od 5 ×). Od temeljne otopine možete pripraviti odmjere radne otopine, te onda njih koristiti u svakodnevnom radu.

Probe se najčešće isporučuju već otopljene u 1× TE puferu, u koncentraciji 50–100 mM (podatak na dokumentu koji dolazi s probom). Pri razrjeđivanju do radne otopine koristite 1× TE pufer ,a za rad s probama je bitno da ih prilikom korištenja ne izlažete izravnoj sunčevoj svjetlosti (možete ih omotati u alu-foliju). Temeljnu je otopinu preporučljivo držati na -20 °C i što ju rjeđe smrzavati i razrjeđivati (preporučamo ne više od 5 ×). Od temeljne otopine možete pripraviti odmjere radne otopine, te onda njih koristiti u svakodnevnom radu.

Za volumene i koncentracije potrebne za daljnji rad, molimo da provjerite upute u proizvođačkom protokolu za rad s npr. Taq Gold polimerazom, ili Universal PCR Master mixom i sl.

   Endogene kontrole omogućavaju normalizaciju izražaja ciljnog gena (target gene) u odnosu na drugi gen izražaj kojeg je između ispitivanih uzoraka stalan (housekeeping gene). Endogena kontrola se u tom smislu rabi za ujednačavanje razlika količina cDNA korištenih u reakciji PCR.

Odabir prikladne endogene kontrole ovisi o više čimbenika, a može zahtijevati podosta vremena te time i sredstava. Tipičini problemi uključuju činjenicu da razina izražaja tradicionalnih hosekeeping gena, poput GAPDH i β-aktin može značajno varirati između pojedinih tkiva ili razvojnih stadija istog tkiva. Postojanje pseudogena nadalje komplicira ovu zadaću.

Od velike pomoći pri odabiru odgovarajuće endogene kontrole može biti Human Endogenous Control Plate (kataloški broj, part nuber: P/N 4309920). Taj kit sadrži početnice (primer) i probe (probe) za procjenu izražaja 11 često korištenih housekeeping gena, i to: 18S rRNa, acidic ribosomal protein, β-actin, cyclophilin, glyceraldhyde-3-phosphate dehydrogenase, phosphoglycero-kinase, β2-microglobulin, β-glucronidase, hypoxanthine ribosyl transferase, transcription factor IID/TATA binding protein, transferrin receptor. Ovi eseji ne će otkriti gDNA (osim 18S) te ih se s obzirom na taj kriterij testira tijekom svakog proizvodnog ciklusa. Iako esej za 18S rRNA nije specifičan za cDNA, izuzetno visoka razina izražaja rRNA omogućava zanemarivanje mogućeg zagađenja genomskom DNA. Uz to, svih 11 eseja sadrži i unutarnju pozitivnu kontrolu (IPC; internal positive control) s pomoću koje je moguće utvrditi postojanje inhibitora reakcije PCR.

Nakon što se, primjerice, s pomoću Human Endogenous Control Plate probere prikladan gen, u konkretnim pokusima moguće je služiti jednom od dvije mogućnosti.

1) Uobičajeni eseji za genski izražaj, TaqMan Gene Expression Assay, pri čemu odaberete gen koji Vas zanima (molim, uočite da pri naručivanju svi Gene Expression eseji imaju isti kataloški broj: P/N 4331182).

2) Eseji za housekeping gene, TaqMan Endogenous Control (za neke gene postoje oba). Pri naručivanju Vas molimo da sami odaberete odgovarajući kataloški broj. Primjera radi, ljudski β-aktin obilježen bojom VIC ima P/N 4326315E, dok mišji β-aktin obilježen bojom VIC ima P/N 4352339E.

U čemu je razlika, osim u kataloškim brojevima? Sljedovi početnica i proba su jednaki, razlika je u načinu proizvodnje, a neki pripravci eseja TaqMan Endogenous Control dostupni su i kao početnicom ograničeni (primer limited) te se pogodni za umnogostručivanje (multiplexing). Napominjemo da, za razliku od uobičajenih eseja za genski izražaj (TaqMan Gene Expression Assay), pri TaqMan Endogenous Control esejima proba sama ne mora nužno premoštavati egzone (exon spaning), ali zato cijeli amplikon premoštava egzon.

Popis dostupnih TaqMan Endogenous Control eseja dostupan je preko sljedeće poveznice.

U našoj ponudi postoji nekoliko vrsta eseja za genski izražaj.

Prvo, postoje eseji koje je Applied Biosystems unaprijed razvio. Određeni TaqMan esej za genski izražaj možete pronaći na internetskoj stranici www.allgenes.com, izborom Search & Order Assays. Postojeći eseji mogu se pretraživati prema broju (NCBI RefSeq ID), nazivu gena, genskoj porodici te funkcionalnim skupinama i podskupinama. Tvrtka opsežno provjerava funkcionalnost svakog eseja, te ova mogućnost nudi najveću sigurnost. Također napominjemo da uz esej dobijate gotov i optimizirani protokol. Postoje dvije skupine pripremljenih eseja: inventoried i made-to-order. -Inventoried: Ovo su eseji koji su već proizvedeni, pohranjeni su na skladištu te su spremni za isporuku. Isporučuju se u koncentraciji 20×, za 100 reakcija od 50 μL. -Made-to-Order: Ovo su eseji koji se proizvode i isporučuju tek prilikom pristizanja narudžbe. Također se isporučuju se u koncentraciji 20×, ali za ukupno 140 reakcija od 50 μL. Za oznake pojedinih eseja molimo pročitajte FAQ-3.

Ukoliko ne postoji gotovi esej za gen koji Vas zanima, ili želite imati više nadzora nad sustavom, postoje dvije mogućnosti: jedna je da Applied Biosystems oblikuje esej za Vas (znači odabere i probe i početnice (primer)), a druga da sve obavite sami te da od Applied Biosystemsa naručite odgovarajuće oligonukleotide.
-Custom made: Ovo su eseji koje Applied BioSystems oblikuje za Vas, na temelju slijeda koji nam pošaljete. Pri tome je potrebno rabiti besplatni software, File Builder (LINK). Za više informacija provjerite mrežnu stranicu Custom TaqMan Assays (LINK). Molimo, uočite da su ovakvi eseji testirani in silico.
-Posebno naručivanje početnica i proba za Vaš slijed: Naravno, možete i sami oblikovati sljedove početnica i probe koje Vam trebaju te izabrati kataloški broj (molimo pogledajte FAQ-1, FAQ-2). Uočite molim da je optimizacija Vaša zadaća. Ukoliko radite jednostruku (singleplex) reakciju za probu se preporuča da bude obilježena bojom FAM. Pri umnogostručenim (multiplex) reakcijama, ciljani gen preporučamo označiti bojom FAM a endogenu kontrolu bojom VIC. Pri alelnom razlikovanju (alelic discrimination), također preporučamo boje FAM i VIC.

   Control date je stroži pojam od expiration date te označava nadnevak do kojeg se proteže jamstveno pravo kupca (warranty rights). To ne znači da će proizvod nakon tog nadnevka postati neuporabiv, ali Applied Biosystems više ne jamči uporabivost i kakvoću. U ovu skupinu proizvoda pripadaju mnogi proizvodi namijenjeni za PCR, kitovi namijenjeni za forenzičku primjenu te kitovi za molekulsku dijagnostiku.

Za TaqMan Gene Expression eseje postoji i „Use by date“ – vrijeme od pet godina nakon dana proizvodnje eseja. Ukoliko je esej skladišten na preporučeni način, održati će svoju djelotvornost sve do nadnevka Use by date, koji je otisnut na naljepnici. S druge strane, Control date za TaqMan eseje je tipično dvije godine nakon dana proizvodnje.

   Pasivna referentna boja (reference dye) ROX (6-carboxy-X-rhodamine), upotrebljava se za normalizaciju real-time PCR reakcija i sastavni je dio otopina: TaqMan Master Mix i SYBRGreen Master Mix. Naime, ROX daje unutarnju referenciju u odnosu na koju se izražava signal izvjestiteljske boje (reporter dye) (Slika 1). Iako nije ključan za provođenje real-time PCR, Applied BioSystems preporuča uporabu boje ROX iz sljedećih razloga:

normalizira većinu fluktuacija fluorescencije;

kompenzira razlike između pojedinih zdenaca;

regulira sitne razlike u volumenima a time i koncentracijama;

omogućuje visoku preciznost.

Slika 1. Primjer reakcije PCR s (lijevo) i bez (desno) uporabe pasivne referentne boje ROX. Uočite veliku razliuku u preciznosti.

Sama normalizacija provodi se dijeljenjem intenziteta signala izvjestiteljske boje sa signalom pasivne referentne boje. Tako dobijeni kvocijent, koji se računa za svaku reakciju (zdenac) nazivamo Rn (normalised reporter). Rn+ je vrijednost RN u reakciji koja sadrži sve sastavnice, dok je Rn– vrijednost Rn u uzorku u kojem nema umnožavanja/predloška (template). Prema tome ΔRn je razlika tih dviju vrijednosti.

   Da, Applied BioSystems Vam nudi TRI Reagent®, koji u cijelosti odgovara rješenjima drugih proizvođača, kao što su Trizol ili Tri-Sil. 

TRI Reagent® je otopina za izolaciju RNA, DNA, i bjelančevina, koja daje bolje rezultate i veće koncentracije željenih molekula u odnosu na ine organske postupke poput gvanidin-tiocijanata ili cezij-klorida. Izuzetno lako ju se može prilagoditi za izolaciju RNA/DNA/bjelančevina (samo pojedine ili pak sve tri frakcije) iz različitih uzoraka: ljudska, životinjska i biljna tkiva, stanične kulture, bakterijski uzorci, kvasci i virusi. 

RNA pripravljena s pomoću TRI Reagenta prikladna je za RT-PCR (klasični i kvantitativni/real-time), polja (arrays), različite hibridizacije te translaciju in vitro. DNA je pak pogodna za PCR, Southernovu razložbu (blot) ili kloniranje, dok se bjelančevine mogu koristiti za Westernsku razložbu.

Za više informacija i protokole, molim posjetite sljedeću poveznicu.

Za brze odgovore na uobičajena tehnička pitanja, savjete i naputke o primjeni proizvoda tvrtke Applied Biosystems, te uklanjanje teškoća pri radu (troubleshooting) molimo pogledajte odgovarajuće mrežne straniceili pretražite opsežnu bazu već postavljenih pitanja.

Ukoliko imate problema s real-time PCR-om, poticemo Vas da posjetitevodic za uklanjanje problema.

Najtoplije Vam savjetujemo da detaljno pročitate priručnike i ostalu dokumentaciju koja je pridružena proizvodima, a osobito dijelove priručnika koji se bave uklanjanjem teškoća pri radu. Također Vam savjetujemo da pohađate službene treninge koje organizira Applied Biosystems, te Vam svrćemo pozornost na priručnike koje polaznici treninga dobijaju. Ti priručnici također sadrže mnoštvo korisnih informacija.

Prije no što se obratite službi za podršku, molimo imajte na umu prvo pravilo uklanjanja problema: engl. GIGO (=garbage in – garbage out). Drugim riječima, molimo – pošaljite nam čim više informacija! Što više znamo, brže ćemo Vam moći pomoći. Također, ne možemo dovoljno naglasiti koliko nam je važno da nam pošaljete sirove podatke (raw data; datoteke .ab1, .fsa, .sds).
Dakle, recite nam što više. Primjerice!
Koji su Vaš radni uvjeti? Istraživački ili rutinski laboratorij?
Koji je (ukratko) cilj konkretne analize?
Što ste radili, koji postupak? Kvantitativni PCR? Sekvencioniranje? Nešto treće...?
Koju inačicu softwarea koristite?
Kakve uzorke imate? Ljudske? Biljne? Životinjske? Kako prikupljate uzorke? Kako ih obrađujete? Koja tkiva koristite? Je li riječ o primarnoj staničnoj kulturi ili staničnoj liniji? Koje kitove rabite? (Posebno molimo da vodite računa o tome da ne znamo svako moguće zaštićeno ime! – Molimo dajte puna imena i proizvođače!) Ako je moguće, pošaljite protokole.
Koristite li naše kemikalije ili neke druge? Slijedite li naše protokole ili ste ih mijenjali (i kako?)?
Što točno je problem? Kako zapravo možemo pomoći? Je li ovo prvi put da imate baš takav problem? Jeste li radili sami štogod, prije no što ste nam se obratili?
Jeste li iskusni ili ste tek počeli koristiti tehniku o kojoj je riječ?
Ukoliko se na zaslonu pojavila poruka pogrješke, pomoglo bi da nam pošaljete sliku zaslona (sreenshot). Ukoliko to ne znate učinit sami, izvolite pogledati FAQ-12. No, molimo svrnite pozornost da je jako važno da se u trenutku slikanja na ekranu nalazi najvažnija informacija. Primjerice, ako je riječ o logu instrumenta, važno nam je vidjeti dio loga koji se odnosi na događaje neposredno prije no što je nastupio problem.
Na koji točno način ste analizirali podatke? Koje mogućnosti se uključili/isključili u programima za analizu?

   Kako biste fotografirali stanje na zaslonu računala (screenshot) prvo stisnite “Print Screen” puce (Prt Scr). (Možete i pritisnuti Alt + Prt Scr, kako biste fotografirali samo aktivni prozor). Slika će biti smještena u clipboard.

Kako biste ju snimli, ulijepite je u neki program za rad sa slikama (npr. Microsoft Paint; nađite ga ovako: Start > All Programs > Accessories > Paint) ili izravno u Power Point. Korisnici sustava Vista mogu rabiti i Snipping Tool.